New approaches to studying morphological details of intramolluscan stages of Angiostrongylus vasorum / Novas abordagens para estudo morfológico dos estágios intramoluscos de Angiostrongylus vasorum

Abstract Angiostrongylus vasorum is a pulmonary artery parasite of domestic and wild canid. On molluscs, intermediate host, first stage larvae (L1) are found after the first day of infection, in the 8th L2 and in the 30 th L3. It was evaluated L1, L2 and L3 recovered by Baermann technique from Achatina fulica infected with 1000 L1. Fifty larvae/stage were incubated with antibodies anti-β-tubulin, anti-α-tubulin, anti- α-actin, anti-β-actin and anti-collagen, and then with Alexa 633. Fifty larvae/stage were observed with picrosirius red and Oil Red O. It was also observed in the anterior region of L1 the beginning of the chitinous stems development, in the initial portion of the intestine and genital primordium. In L2 anterior region, the papillae, chitinous canes juxtaposed to the mouth and intestines bigger than L1. The L3 musculature is well defined, next to the chitinous stems, there are two round distally arranged from each other. It was observed the whole extension of the intestine genital primordium and intense cellularity in the L3 distal portion. With the picrosirius red the L1, L2 and L3 musculature could be observed, as the nerve ganglia on L3. Oil Red O revealed that L1, L2 and L3 store energy on lipid droplets.

Resumo Angiostrongylus vasorum é um parasito de artérias pulmonares dos canídeos domésticos e silvestres. Nos moluscos, hospedeiros intermediários, encontram-se no primeiro dia após a infecção, larvas de primeiro estágio (L1), ao 8° L2 e ao 30° L3. Avaliou-se L1, L2 e L3 recuperadas pela técnica de Baermann de Achatina fulica infectada com 1.000 L1. Incubou-se 50 larvas/estádio com anticorpos anti-β-tubulina, anti-α-tubulina, anti-β-actina e anti-colágeno e, em seguida, com anticorpo Alexa 633. Observaram-se também 50 larvas/estádio com picrosirius red e Oil Red O, na região anterior da L1, o início do desenvolvimento de hastes quitinosas, a porção inicial do intestino e o primórdio genital. Na região anterior de L2, papilas, bastões quitinosos justapostos à boca e ao intestino maior que em L1. A musculatura de L3 é bem desenvolvida, próximo às hastes quitinosas, há duas estruturas redondas dispostas distalmente uma da outra. Observaram-se também toda a extensão do intestino, o primórdio genital e a intensa celularidade na porção distal da L3. Com o picrosirius red observou-se a musculatura de L1, L2 e L3, assim como, gânglios nervosos na L3. Oil Red O revelou que L1, L2 e L3 armazenam energia em gotículas lipídicas.

Evaluation of techniques for recovery of Angiostrongylus vasorum from Achatina fulica, a potential intermediate host

Mollusks are intermediate hosts of Angiostrongylus vasorum, which is a parasite with zoonotic potential for which canids are the definitive host. In this study, 180 specimens of Achatina fulica that had been experimentally infected with 1,000 L1 of A. vasorum were finely chopped to evaluate four tissue digestion techniques: 1% potassium hydroxide (group I); 3% hydrochloric acid (group II); 1% hydrochloric acid and pepsin (group III) with procedures at 37 ºC in a double boiler; and Baermann at 42 °C (group IV). On the first, eighth and thirtieth days after infection, L1, L2 and L3 were obtained, and 240 L3 recovered from group III were offered to a dog. The results were the following: group I: 59% L1, 7% L2, 13% L3; group II: 31% L1, 13% L2, 27% L3; group III: 23% L1, 22% L2, 30% L3; and group IV: 0.3% L1, 0.02% L2, 5% L3. Live larvae wereobserved in group III: 15.5% L1, 8.22% L3; group II: 9.8% L3; and group IV: 100% L1, L2 and L3. Larvae were detected 56 days after the dog became infected. All larvae stages of A. vasorum were recovered and identified through the techniques evaluated, thus confirming the potential of A. fulica as an intermediate host of the nematode

Optimization of protease production by the fungus Monacrosporium thaumasium and its action against Angiostrongylus vasorum larvae / Otimização da produção de protease pelo fungo Monacrosporium thaumasium e sua ação contra larvas de Angiostrongylus vasorum

The objectives of this study were to optimize protease production from the nematophagous fungus Monacrosporium thaumasium (NF34a) and evaluate its larvicidal activity and biological stability. An isolate of the nematophagous fungus Monacrosporium thaumasium (NF34a) was used to produce the enzyme. The Plackett-Burman design was used in order to scan which components of the culture medium could have a significant influence on protease production by the fungus NF34a. An in vitro assay was also performed to evaluate the larvicidal activity of NF34a. It was observed that only one component of the culture medium (yeast extract), at the levels studied, had any significant effect (p < 0.05) on protease production. There was a reduction (p < 0.01) in the mean number of larvae recovered from the treated groups, compared with the control groups. The results confirm previous reports on the efficiency of nematophagous fungi for controlling nematode larvae that are potentially zoonotic. Thus, given the importance of biological control, we suggest that further studies should be conducted on the protease produced by the fungus Monacrosporium thaumasium.

O objetivo deste trabalho foi otimizar a produção de proteases do fungo nematófago Monacrosporium thaumasium (NF34a), avaliar sua atividade larvicida e sua estabilidade biológica. Foi utilizado um isolado do fungo nematófago Monacrosporium thaumasium (NF34a) para a produção de enzima. O delineamento Plackett-Burman foi utilizado com o objetivo de se escanear quais componentes do meio de cultura, poderiam ter influência significava na produção de protease pelo fungo NF34a. Foi realizado um ensaio in vitro para avaliar a atividade larvicida de NF34a. Observou-se que apenas um dos componentes do meio de cultura (extrato de levedura), nos níveis avaliados, apresentou um efeito significativo (p < 0,05) sobre a produção de protease. Houve redução (p < 0,01) entre as médias de larvas recuperadas dos grupos tratados em relação às dos grupos controle. Os resultados confirmam trabalhos anteriores da eficiência de fungos nematófagos no controle de larvas de nematóides potencialmente zoonóticos. Assim, devido a importância do controle biológico, os autores sugerem estudos mais aprofundados sobre a protease produzida pelo fungo Monacrosporium thaumasium.

In vitro predatory activity of conidia of fungal isolates of the Duddingtonia flagrans on Angiostrongylus vasorum first-stage larvae

INTRODUCTION:Angiostrongylus vasorum is a nematode that parasitizes molluscs, dogs, and even man. METHODS:The objective was to evaluate the predatory activity of the conidia of two fungal isolates of Duddingtonia flagrans (AC001 and CG722) on first-stage larvae (L1) of A. vasorum in laboratory conditions. RESULTS: At the end of the experiment, there were significant reductions (p<0.01) of 74.5% and 63.2%, on average, in the A. vasorum (L1) recovered in the AC001 and CG722 treatment conditions, respectively. CONCLUSIONS: The two isolates of fungi were efficient in the capture and destruction of A. vasorum (L1).

Atividade larvicida do extrato bruto enzimático do fungo Duddingtonia flagras sobre larvas de primeiro estádio de Angiostrongylus vasorum / Larvicidal activity of a crude enzyme extract of the fungus Duddingtonia flagrans on first-stage larvae of Angiostrongylus vasorum

INTRODUÇÃO: Angiostrongylus vasorum é um nematóide que parasita cães domésticos e eventualmente o homem. MÉTODOS: O objetivo deste trabalho foi observar a atividade predatória in vitro do extrato bruto enzimático do fungo Duddingtonia flagrans sobre larvas de primeiro estádio A. vasorum em condições laboratoriais no meio ágar-água 2 por cento. RESULTADOS: Ao final do experimento, os percentuais de redução das L1 de A. vasorum observados foram de: 53,5 por cento (24h) e 71,3 por cento (48h) CONCLUSÕES: O extrato bruto enzimático do fungo D. flagrans destruiu in vitro as L1, podendo ser utilizado como controle biológico desse nematóide.

INTRODUCTION: Angiostrongylus vasorum is a nematode parasite of domestic dogs and potentially of humans. METHODS: This study aimed to observe the predatory activity in vitro of a crude enzyme extract of the fungus Duddingtonia flagrans on first-stage larvae of A. vasorum in laboratory conditions on 2 percent water-agar. RESULTS: At the end of the experiment, the percentage reductions observed for A. vasorum L1 were 53.5 percent (24h) and 71.3 percent (48h). CONCLUSIONS: Crude enzyme extract of the fungus D. flagrans destroyed the L1 in vitro and can be used as a biological control for this nematode.

Apoptose e Morfometria das Lesões Granulomatosas induzidas pelo Angiostrongylus vasorum em cães / Apoptosis and morphometry of the granulomatous lesions induced by the Angiostrongylus vasorum in dogs

O Angiostrongylus vasorum (Baillet, 1866) é um nematódeo da família Protostrongylidae que habita o átrio e o ventrículo direitos, e artéria pulmonar de cães domésticos e de outras espécies de Canídeos em diversos continentes. A angiostrongilose induz a formação de granulomas de composição e volume variáveis nas diferentes fases do processo nos pulmões e em vários órgãos nos animais acometidos. Fragmentos de pulmão embebidos em parafina e obtidos de 12 animais sem raça definida, infectados experimentalmente com larvas de A. vasorum, foram seccionados a 5mm. Os cortes foram corados em hematoxilina e eosina e analisados ao microscópio óptico. As lesões foram classificadas em leves, moderadas e intensas de acordo com a historia clinica e o aspecto morfológico dos tecidos. Foram analisados os seguintes parâmetros morfométricos: área dos granulomas, número de larvas/ovos por área e ocorrência de apoptose nos granulomas e em células gigantes. Os resultados obtidos revelaram que o aumento do número de larvas/ovos é diretamente proporcional ao aumento da área e ao agravamento da lesão é inversamente proporcional ao índice apoptótico; as células gigantes eram em maior número em lesões moderadas e, quando presentes, grande parte delas apresentavam núcleos com morfologia de apoptose, sugerindo que estas possam ter um tempo de vida curto.

Angiostrongylus vasorum (Baillet, 1866) is a nematode of the Protostrongylidae family that inhabits the right side of the heart and the pulmonar artery of domestic dogs and other Canidea in different continents. Angiostrongylosis induces granuloma formation with variable volume and composition in different phases in lungs and in other organs. Lung fragments embedded in wax obtained from 12 mongrel dogs experimentally infected with larvae of A. vasorum were sectioned and stained with Hematoxiline Eosine and analyzed at light microscopy. Lesions were classified in mild, moderate and severe according to clinical history and morphological aspect. The following morphometric parameters were analyzed: granuloma area, number of larvae/eggs per area and apoptosis in granulomas and inside giant cells. Increase of number of larvae/eggs was proportional to increase in area and in intensity of the inflammatory reaction and to decrease in apoptosis. Giant cells were more frequent in moderated lesions and, when visible, most presented condensed or fragmented nuclei with evidence of apoptosis. Apoptosis were less frequent in severe lesions, when granulomas were the largest. It is possible that giant cells have a short life in angiostrongylosis.

Occurrence Angiostrongylus vasorum (Baillet, 1866) (Nematoda, Angiostrongylidae) in Cerdocyon thous Linnaeus, 1766 (Carnivora, Canidae) in Minas Gerais State Brazil

Registrou-se a ocorrência de A. vasorum em C. thous no Estado de Minas Gerais, e estudaram-se aspectos de sua ecologia nessa população de hospedeiros. A partir da necropsia de seis espécimes, observou-se a presença de A. vasorum nos pulmões e átrio direito de C. thous. No total foram coletados 24 espécimes de A. vasorum, com prevalência de 50 por cento, abundância média de 4±4,47, intensidade média de 8±3,00 e razão sexual (machos/fêmeas) de 1:1,19. As infrapopulações de A. vasorum apresentaram padrão de distribuição espacial agregado (ID=5,70 e K=0,355). Este é o primeiro registro de A. vasorum em C. thous no estado, descrito no município de Juiz de Fora